Isolation par Chromatographie Flash MS de produits naturels en phase normale

1. Introduction

L’amélioration des techniques analytiques et des outils méthodologiques joue un rôle important dans la caractérisation et l’isolation des métabolites secondaires bioactifs dans la recherche sur les produits naturels. La chromatographie liquide en phase inverse MS (RP-LC-MS) est largement utilisée pour le profilage des métabolites d’extraits naturels complexes au niveau analytique et commence à être de plus en plus utilisée pour l’isolation ciblée des biomarqueurs. La chromatographie en Phase normale (NP-LC) est bien adaptée à la purification des métabolites secondaires apolaires  offrant également certains avantages par rapport à la RP (phase inverse) comme de faibles pressions de fonctionnement et des phases stationnaires moins chères.

La LC en phase normale n’est toutefois pas très compatible pour le fractionnement par la masse. Le potentiel de la NP-LC-APCI-MS pour la purification du métabolite à l’échelle préparative à l’aide de méthodes de séparation génériques a été étudiée en pression medium sur le système de chromatographie préparative (PuriFlash® – MS) en vue de son application : l’isolation (ciblée par MS) de métabolite secondaire lipophile. Un mélange de trois produits naturels apolaires représentatifs a été utilisé pour optimiser la séparation, la fragmentation et l’ionisation par la masse dans des conditions imitant les cas réels d’isolation. Enfin, une isolation réussie des composants apolaires de l’extrait de racines de Angelica archangelica dans le dichlorométhane a été réalisée.

 

2. Isolation rapide d’un mélange représentatif d’un produit naturel apolaire par Chromatographie Flash – APCI/MS en phase normale

 

A. Purification d’un mélange de produits naturels sur des colonnes Flash en phase normale 12g et 25g

Trois étalons disponibles sur le marché (caryophyllene oxide, khellin et alpha santonin) ont été choisis afin d’évaluer l’applicabilité du système Flash UV/APCI MS comme un outil pour une purification rapide de composés lipophiles provenant d’extraits de plantes bruts.

Les quatre chromatogrammes montrent le profil du mélange à l’échelle préparative avec des gradients rapides sur deux tailles de colonnes avec un bon chevauchement des signaux UV et MS.

Tous les paramètres ont été soigneusement optimisés pour à la fois la séparation et la détection. Un soin spécial a été pris pour trouver des conditions d’ionisation et de fractionnement qui fournissent une bonne détection et empêcher la contamination à la source.

 

B. Purification par Flash MS d’un produit donné

 

C. Schéma de dilution de la pompe de make-up

– Débit : 20mL/min.
– A : Hexane+0.1%F.A. B : Isopropanol+0.1%F.A.
– Colonne PuriFlash SIHP 15µm 12g – 25g
– Concentration du mélange de produits naturels : 40mg/mL
– Volume injecté : 500µL
– Solvant de dilution : ACN ou MeOH +0.1%FA
– Temps de scan MS : 1500ms
– Gamme de scan MS : m/z 200 – m/z 800
– Méthode d’ionisation MS : APCI
– Paramètres APCI :
Polarité : ion positif (+)
Température de capillarité : 200°C
Température de la source de gaz : 280°C
Voltage de capillarité : 180V
Décharge par effet couronne APCI : 5V

Système de chromatographie Flash – APCI/MS

 

Pour la source APCI, les solvants hautement inflammables provenant de la phase normale devraient être évités du fait du processus de chauffage et il faut être également particulièrement prudent. Afin d’avoir une ionisation efficace et sécurisée, une dilution optimisée post colonne  a donc été obligatoire. Le mélange de solvant atteignant définitivement le détecteur MS a été supérieur à 99% pour l’acétonitrile ou le méthanol. La détection APCI-MS avec des conditions de fractionnement optimisées, et une élution post-colonne du solvant approprié se sont révélées fiables et bien adaptées pour ce type de purification.	Paramètres optimisés du split dynamique	Système compact simple quadrupole APCI/MS

 

3. Purification NP MS d’extrait de racines d’Angelica archangelica en phase normale

Analytical HPLC-UV

Échelle analytique : – Longueur de colonne (L1) : 250mm – Diamètre de colonne (d01) : 4.6mm – Taille de particules (dp1) : 15.0µm – Volume mort de la colonne : 3.17mL – Volume de passage (Vd1) : 1.1mL – Débit (F1) : 1mL/min – Volume d’injection : 20µL

Step Time (min) %A %B 1 0 2.56 2.56 2 15 9.57 9.57 3 45 4.00 4.00 4 55 9.06 9.06 5 60 4.50 4.50

Échelle préparative : – Longueur de colonne (L2) : 140mm – Diamètre de colonne (dO2) : 25.0mm – Taille de particules (dp1) : 15.0µm – Volume mort de la colonne : 40.45mL – Volume de passage (Vd2) : 21mL – Débit (F2) : 1mL/min – Volume d’injection : 20µL

Step Time (min) %A %B Initial conditions 0 95 5 Initial hold 11 75 25 3 35 60 40 4 43 0 100 5 47 0 100

Débit suggéré : 30mL/min
Volume d’injection suggéré : 33mL
Changement de contre pression : ±3.3
Changement d’efficacité : ±1.8
Changement de temps d’analyse : x1.0
Consommation de solvant : x 12.5

Transfert géométrique

Flash Preparative UV-ELSD-MS

Les racines d’Angelica sont riches en dérivés de coumarine

La détection MS-ELSD en complément de la détection UV a permis de contrôler les métabolites secondaires sans ou avec peu de chromophores et la sélectivité de la MS a été d’une grande aide pour une collection précise des composés partiellement co-élués Fonction de la collection du déclenchement de la masse XIC.

Collection BERGAPTEN		Visualisation des données APCI + MS		Collection de fonctionnalités XIC déclenchées par MS
				Ion source parameters Parameter Value Polarity Positive Capillary Temperature 200.0 °C Capillary Voltage 180.0 V Source Voltage 30.0 V Source Voltage Dynamic 30.0 V APCI Source Termperature 280.0 °C Corona Discharge 5.0 V

 

4. Conclusion

La purification Flash en phase normale représente une stratégie efficace pour une isolation rationnelle de biomarqueurs lipophiles spécifiques ou des composés bio-actifs basés sur des résultats de profilage de métabolites. Le fractionnement MS et la surveillance ELSD en plus de la détection UV standard est un outil important pour une collection précise et pour estimer la quantité de produits séparés. La MS est particulièrement utile pour la collection spécifique pour une fonction m/z donnée dans le cas où la co-élution se produit souvent dans les extraits bruts en utilisant des méthodologies chromatographiques à haut chargement et faible capacité de pic. Cette approche rapide et rationnelle peut être largement utilisée pour des purifications à une étape et pour l’isolement des mélanges synthétiques et naturels. Ceci est également compatible avec la détection de composés apolaires qui manquent de chromophores et qui sont très communs dans la recherche sur les produits naturels. La séparation réalisée à l’échelle préparative permet de purifier des dizaines voire centaines de milligrammes de composés pour une identification structurale plus poussée et l’analyse de leurs bioactivités.

 

5. Référence

Davide Righi¹, Antonio Azzollini¹, Emerson Ferreira Queiroz¹, Jean-Luc Wolfender¹
School of pharmaceutical sciences, University of Geneva, University of Lausanne, 30 Quai Ernest-Ansermet, 1211 Geneva 4, Switzerland
[1] Davy Guillarme, Dao T.T. Nguyen, Serge Rudaz, Jean-Luc Veuthey, Eur. J. Pharma. Biopharma. 2008, 68, 430